POCT分子诊断开发拦路虎 - 检测试剂形态挑战

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☞ POCT技术背景

☞ POCT试剂相关原料要求

☞ 罗氏诊断工业原料

 POCT技术背景

近年来POCT技术（point-of-care testing）因其可即时检测，快速出报告的特点，得到广泛的关注和快速的发展。同样POCT在分子诊断中的重要性正在迅速增长，基因检测也有了即时检验的需求。实现准确且快速的床旁检测诊断，操作简单、携带方便、反应快速、灵敏度高和对环境要求低是相关检测产品所需达到的重要性能指标。

目前在新冠疫情的防控中，核酸检测发挥了巨大作用，在即到即做、快速报告需求下，新冠病毒核酸POCT技术也应运而生。近日在《第三届东方分子诊断学术会议》的“感染性疾病分子诊断论坛”上，发布了《病原体核酸即时检测（POCT）质量管理要求专家共识》。该《共识》从应用场景、生物安全管理、标本采集及预处理、性能验证、室内质控、室间质评等方面形成了共识。其中关于性能验证分别在符合率、精密度和检测限三方面提出了具体的严格的要求。

POCT试剂相关原料要求

POCT检测方案开发时对灵敏度、检测速度、抑制剂耐受性以及试剂保存运输都有着特殊的要求。并且为了达到即时检测快速出报告的目的，POCT试剂开发时大多都选择了室温保存和运输的技术路线。相关试剂盒运输无需冷链，极大的提高了便利性并降低了对环境的要求，与此同时对于相关原料的选择也提出了新的要求。

首先为了达到室温稳定储存的要求，POCT试剂盒大多选择了冻干的技术路线，这就要求相关试剂提供无甘油包装，并且可在无甘油条件下稳定存储；其次为了达到快速出报告的需求，POCT试剂简化甚至是省略了核酸提取的环节，不可避免的会将样品中抑制物引入到PCR检测环节，这就要求核心检测试剂有较强的抑制剂耐受性能；同样为了快速出报告的需求，需加快PCR循环的进程，减少PCR整体反应时间，这同样也要求相关核心酶类可以应对快速PCR需求；最后分子POCT检测操作简便，降低了对实验人员操作的要求，与此同时却大大加大了开发难度，但对检测性能的要求没有减少，即与传统检测应该有着一样的检测灵敏度和检测性能。

罗氏诊断工业原料

罗氏诊断工业原料提供的AptaTaq DNA聚合酶、同时具有逆转录和聚合酶活性的HawkZ05 Fast聚合酶系列可以提供高浓度、不含甘油的包装形式。酶的性能也能保证反应液在冻干过程和随后的贮存过程中的稳定性，在冻干前后显示相同的高性能（图1），为检测方法的设计提供更大的灵活性。

图1：对于新配制的预混液以及干燥剂型（在 37℃下贮存 2、6 和 16 周后）进行平行试验，比较 AptaTaq DNA 聚合酶在干燥及保存后的 PCR 性能。在96孔板上干燥 AptaTaq DNA 聚合酶与 PCR 引物和探针。反应前加入水并添加 DNA 模板后，使用实时荧光 PCR 测定 Cp 值。图片来源：Roche R&D 实验数据。

AptaTaq DNA聚合酶、HawkZ05 Fast聚合酶均属于寡核苷酸适配体修饰的热启动酶，具有温度依赖性三级结构（图2）。

图2：寡核苷酸适配体-酶混合物是一个可逆的，温度依赖性热启动系统 。适配体作为分子开关用于聚合酶的激活。通过在较低温度下，寡核苷酸适配体与聚合酶紧密结合，实现酶活性抑制。将温度降至+55°C以下，聚合酶活性关闭；在高于+60°C 的温度，聚合酶活性实现完全活化。图片来源：罗氏诊断收集。

与化学修饰的热启动酶不同，适配体修饰无需热启动时间，这样每次运行可节省多达10-15分钟的时间，加快检测进程；同样与基于抗体的封闭方法也不同，适配体相对于抗体对温度变化更不敏感，因此可在更剧烈的温度下保持稳定，保证其对Taq酶的封闭效果；另外非常重要的是寡核酸适配体可以作为Taq酶的一种稳定剂，极大的增加Taq酶在常温下甚至更高温度下的稳定性，降低产品对冷链的依赖。

另外罗氏诊断工业原料提供的NxtScript家族是一种突变设计的逆转录酶，在越来越高的温度下选择性的朝热稳定性进化。NxtScript 2G逆转录酶是该系列的最新成员，它将逆转录步骤的温度提高到了新的水平：即使在70℃时活性也不会损失。能够轻松检测困难的RNA靶标，在较高温度下，RNA二级结构会打开，不再阻止扩增。能够应对高GC含量区域，酶的热稳定性不再限制解链温度。灵活的冻干即用型试剂，轻松地将NxtScript 2G RT整合到反应优化中，可以单独冻干或与其它试剂混合。并可提供浓度≥500U/μl无甘油形式（图3）。同时NxtScript 2G RT也有一定的耐受抑制能力，无论是处理困难的样品类型，还是通过减少样品制备流程来缩短获得结果的时间，都可以获得可靠的结果。

图3：将在存储液中的NxtScritp 2G RT直接冻干，无进一步优化，与保留的新鲜组进行测试。冻干样品的性能显示活性没有损失。图片来源：Roche R&D 实验数据

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