攻坚新冠之利刃：BioTek的微孔板设备助力搭建新冠病毒蛋白酶抑制剂高通量筛选平台

与“新冠”的持久战

2020年初的新冠全球疫情爆发之际，Agilent BioTek在第一时间整理出了微孔板检测设备在抗击新冠病毒的研究中可以参与的实验项目，并且后续推出了较为全面的抗病毒药物开发解决方案。

上图：Agilent产品在抗病毒药物开发体外实验解决方案

至今为止，并且这场席卷全球的流行病从各个方面改变了我们的生活和工作方式，虽然这种单链RNA病毒仍然未被彻底消灭，但是全球相关岗位上的科学家及工作人员们已经积累了大量的科研成果，涉及基础研究、疫苗，抗体，抗病毒药物的开发的各领域，其中不乏Agilent相关设备的使用。

近期小编将挑选其中使用频率较高的实验和大家进行分享，希望能够帮助开展相关检测项目的老师更高效的使用现有的设备。

上图：截至目前为止，Cytation系列产品在新冠病毒相关领域已发表170篇以上的出版物，其中不乏影响力颇高的顶级杂志。

第一弹：来自中国团队的国际首创——成功开发基于FP技术的新冠病毒抑制剂高通量筛选平台

近期，来自国内皖南医学院陈云雨副教授团队联合中国医学科学院-北京协和医学院医药生物技术研究所司书毅教授团队报道了一种新型基于荧光偏振（FP，fluorescence polarization）技术和生物素-亲和素反应（biotin-avidin system）原理的Mpro小分子抑制剂高通量筛选方法，研究成果发表在Cell & Bioscience杂志，这是国际首次将FP技术应用于靶向Mpro的抑制剂筛选中。

新冠病毒属于单链RNA病毒，其本身变异性高，目前针对新冠病毒肺炎疫情的各项策略齐头并进，除了各类疫苗及中和抗体类产品的开发，针对靶向病毒及宿主特异性靶点的药物也是各大研究机构及相关企业攻坚的方向。

目前在研的开发靶点包括靶向病毒于宿主细胞膜融合环节、抑制病毒在细胞内的翻译转录复制环节及成熟病毒颗粒的释放三大病毒生命周期的各项环节，其中新型冠状病毒主蛋白酶Mpro（也被称为3C-like protease, 3CLpro），由于其主要参与病毒在细胞内的翻译转录复制，进化保守，且人体内没有同源蛋白，因此Mpro主蛋白酶是一个抗病毒药物研发的理想靶点。

上图：SARS-CoV-2的Mpro的蛋白质结构，图片来源于中国科学院上海生命研究所。

目前针对Mpro蛋白酶靶点的体外高通量筛选技术包括联合计算机虚拟筛选、荧光共振能量转移（FRET）法、荧光素酶报告基因筛选法、FlipGFP生物传感器活细胞筛选法等，但这些方法在早期药物开发中，时间成本及经济成本等均有待提升。陈云雨和司书毅研究团队开发的基于FP技术的筛选模型恰好弥补了这些短板。

荧光偏振小剧场

先来简介一下荧光偏振技术（荧光的基本原理和偏振光的基本原理如果有不懂的童鞋请自行百度啦，或者后台骚扰小编也可以）。

Perrin于1926年首先描述了荧光偏振的理论，他发现当溶液中的荧光分子受到偏振光激发时，如果分子保持静止，该分子将发出固定偏振平面的发射光（就是这个发射光仍保持偏振性）。然而如果分子旋转或翻转，那么发射光的偏振平面将不同于初始激发光的偏振平面（偏振性下降）。

影响这一过程的主要因素是分子的旋转弛豫时间，也就是分子动的越快，偏振性下降越大。而分子旋转弛豫时间在液体粘度、绝对温度相同的条件下，又主要受到分子体积的影响，所以如果分子量大，同样强度偏振光激发后，检测到的发射偏振光偏振性高，相反，如果分子量小，检测到的发射光偏振性降低。

因此，以荧光偏振基础发展的技术可用来研究生命科学领域中分子之间的相互作用或特定分子检测，它最大的特点是可以实时跟踪检测分子间结合/分离的变化，解决了困扰荧光技术使用者们对于荧光无法定量的烦恼，并且相对于其他荧光分子互作技术，FP成本低、灵敏度高，可开发均相体系，非常适合用于开展分子检测及高通量药物筛选。

荧光偏振技术如何应用于Mpro抑制剂的筛选？

虽然荧光偏振技术已经较为广泛的应用于临床免疫检测、人畜共患病检测以及基础科研的分子相互作用检测，但是在抗新冠病毒药物筛选领域中，特别是基于Mpro蛋白酶抑制剂的筛选中尚未开发出成熟体系。

陈云雨和司书毅研究团队通过巧妙地设计，构建荧光探针FITC-S-Biotin（FITC-AVLQSGFRKK-Biotin，下图紫红色虚线）作为FP示踪剂Tacer，该Tracer具有三明治样结构：中间包含了Mrpo蛋白酶（下图的剪刀）的酶切位点，一端偶联了FITC荧光探针（下图绿色原型），另一端是Biotin，可以与蛋白Avidin（下图红色新月形）特异性结合，形成分子量较大的结构。

当存在活性抑制剂（下图蓝色六边形）阻断Mpro酶切功能时，未被Mpro切割的Tracer具有较大的荧光偏振值；当存在Mpro蛋白酶及非活性抑制剂（下图棕色六边形），tracer被切断，FITC端释放成为小分子，荧光偏振值下降。利用该体系，可筛选具有抑制Mpro酶活性的化合物。

上图：三明治样FP Tracer筛选原理示意图

经过多项优化实验后，研究团队验证了该FP筛选体系的适用性和质量稳定性，我们知道， Z 因子是高通量筛选（HTS）实验评估和验证中使用最广泛的参数，基于此FP为基础的筛选体系的Z因子可以达到0.85。

上图：基于FP筛选模型的质量验证

研究团队应用本筛选模型对天然产物化合物库进行高通量筛选，成功筛选到新型的竞争性抑制剂二鹅掌菜酚（Dieckol），它是一种从Ecklonia cava提取的天然多酚类化合物，具有良好的Mpro抑制活性，在无DTT存在条件下，其IC50值为2.9±0.2 μM。表面等离子共振实验（SPR）结果表明，Dieckol与Mpro具有较高的亲和力，KD值为0.22 μM。后续的分子对接模型结果表明，二鹅掌菜酚能与Mpro活性中心形成牢固的氢键，证实了其竞争性结合模式。

上图：天然产物库初筛结果，筛选到有效化合物Dieckol

该基于FP的筛选模型有哪些优势？

该研究的主要开发者之一的陈云雨老师评价，与常规的FRET筛选方法相比，在本荧光偏振筛选模型中，底物的单孔使用量仅为20 nM，为FRET筛选模型中底物单孔使用量的1/500；并且该方法操作简便，每轮筛选时间仅为1 h，具有极高的稳定性、灵敏性和经济性，用一句话来说，就是“快，省，准”！。

最后，什么样的设备能够更好的支持该FP筛选模型？

文章中所有的微孔板实验，包括FP和FRET动力学检测采用的是BioTek的Cytation5多功能微孔板检测系统，这套设备最大的优势是采用的全球专利技术Hybrid技术，其灵活的四光栅模块，支持各类基于的FRET酶底物切割动力学检测筛选，而其高灵敏性能的滤光片模块，则为此文中重点的荧光偏振实验提供了稳定可靠的数据输出保障。

该研究负责的老师评价：“Agilent BioTek的仪器很好用，文中的大部分数据都依靠该设备获得”。

此外，Cytation可友好对接自动化设备，比如BioStack或者Agilent的BenchCel，可以实现多块微孔板的自动读板及液体处理步骤。

上图：Cytation& EL406洗板机与BenchCel的自动化对接