70℃！BioTek的产品又双叒叕火热升级了！

核酸等温扩增技术

    介绍LAMP技术前，我们先回顾一下核酸等温扩增技术，相对于我们经典熟知的聚合酶链式反应（PCR）技术，等温扩增可以在恒定温度下快速有效地扩增核酸序列，并不需要复杂的热循环以介导的变性、退火和延伸等步骤。目前，核酸的等温扩增已成为一种极具应用前景的替代方法。

特异性的核酸等温扩增技术通常包括：

·       环介导等温扩增技术(LAMP)

·       依赖核酸序列的扩增技术(NASBA)

·       单引物等温扩增（SPIA）

·       链置换扩增技术(SDA)

·       信号介导的核糖核酸 扩增技术(SMART)

·       依赖解旋酶的等温扩增技术（HAD）

·       滚环扩增技术(RCA)

·       快速等温检测放大 技术(RIDA)

·       切刻内切酶核酸恒温扩增（NEMA）

·       重组酶聚合酶扩增技术 (RPA)

·       Cas酶的SHERLOCK和DETECTR技术

·       …等等

以上每种方法的引物设计、反应温度及适合的检测样本都各不相同。

LAMP技术简介

    LAMP技术全称是Loop-mediated isothermal amplification（环介导的等温扩增反应），是Notomi等在1998年报道的一种等温核酸扩增技术，它属于核酸等温扩增技术家族的一员。

    LAMP技术需要4-6个引物，在恒温65℃左右的条件下，这些引物能够特异性识别模板DNA的6-8个DNA区间，每套LAMP引物中，包括一对具有回折结构的内引物（FIP和BIP）和一对用于置换单链产物的外引物（F3和B3），在具有链置换活性的Bst DNA 聚合酶作用下，生成两端具有环状结构的哑铃型中间产物，在内引物识别中间产物环状区域引发延伸和回折结构和3′端自发延伸的双重作用下扩增得到超长串联双链DNA 扩增产物（如下图所示）：

上图：LAMP技术的原理示意图，图片来源：Loop-Mediated Isothermal Amplification | NEB

    LAMP反应过程中，核酸扩增释放焦磷酸盐和氢离子，降低了反应溶液的pH值，通过加入pH指示剂，可以通过颜色的变化评价检测结果，另外，也可以通过加入DNA荧光探针，通过荧光强度检测实现产物定量。

LAMP技术的主要特点

·对引物设计要求较高，目前有可以使用的LAMP引物设计软件；

·检测方法灵活，灵敏度高，可兼容现场快检及实验室高通量检测；

·反应速度较快，一些商品化试剂盒，能够在15mins内完成检测；

·对于样本DNA的纯度要求较低，大大减少扩增前样本纯化工作；

使用LAMP技术开展新冠病毒的检测

    由于新型冠状病毒SARS-CoV-2引起的新冠病毒肺炎全球大流行，严重危害人类健康，对病毒的分子诊断产生了迫切需求及更高的要求，需要相关从业者以前所未有的规模快速创建准确和敏感的检测方法，目前市场上虽然有不少数分钟内的“快检”的病毒试剂盒，但是大多无法实现高通量检测，此外快速检测为了追求时间缩短的同时，不可避免的牺牲了灵敏度。

    由于LAMP技术对样本的前处理程度要求不高，并且可通过基础的比色法进行反应终点产物检测，可实现快速高通量的样本检测，基于此技术的新的病毒检测方法的开发也愈发受到关注：

    2020年，来自我国山东济南中心医院、沈阳化工大学应用生物学研究所、牛津大学苏州高级研究中心等多家研究团队陆续开发出基于LAMP技术的新冠病毒现场快速检测方法，济南的研究团队主要技术是在63℃等温条件下，一步法进行RNA逆转录和核酸扩增，30分钟即可得到结果，同时检测ORF1ab基因、E基因和N基因，有效率能达到99%，灵敏度在1000copies/mL；沈阳化工大学的研究团队采用了新型核酸染料GeneFinderTM作为LAMP反应的终点指示剂，在蓝光照射下进行检测，有效提高了检测灵敏度；牛津大学苏州高级研究院的研究团队通过设计4组特定的LAPM引物，使用比色法进行终点检测，灵敏度可达到80copies/mL。

    以上这些研究者们开发的SARS-Cov-2检测方法都是基于肉眼的观察法，优点是可以实现现场快检，但是无法开展大规模高通量筛查，来自美国新英格兰实验室的团队开发出一整基于微孔板检测仪的自动化高通量的方案，可进行96-384孔板体系的检测，其引物设计针对病毒的N基因，As1e基因，N2基因和E1基因，并且他们经过实验发现，通过额外加入40mM的氯胍溶液，可以实现提高LAMP反应检测灵敏度的作用，同时也缩短检测反应时间，在65℃的条件下，反应时间缩短至 20分钟以内。最终产物加入PH指示剂，在微孔板检测仪上测定OD432nm和OD560nm的吸光度。

    该研究团队还提出，可以采用Agilent的Bravo和 MultiFloFX进行全自动样品前处理，采用定制的传送带孵箱进行温控（或选择Thermo的全自动孵育箱），最后采用BioTek(a part of Agilent)的SynergyNeo2进行终点法检测及数据处理，当然，如果不需要多板高通量处理，也可以选择直接使用SynergyNeo2进行温控+检测一步法~

上图：基于LAMP技术的等温扩增高通量终点检测的自动化工作流程示例

LAMP技术的其他应用

    由于LAMP技术的诸多优点，目前在分子检测和诊断方向有诸多应用场景及广阔的应用前景，涵盖了食品安全、医疗疾控、出入境检验检疫、植物保护等多领域，例如免提取DNA步骤的葡萄藤红斑病毒检测、尿液样本开展寨卡病毒检测、口蹄疫病毒检测、转基因成分检测、过敏原成分检测等等项目。

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相关文献：

https://www.medrxiv.org/content/10.1101/2020.03.02.20030130v2.full.pdf

RT‐LAMP for rapid diagnosis of coronavirus SARS‐CoV‐2 - Huang - 2020 - Microbial Biotechnology - Wiley Online Library

https://www.medrxiv.org/content/10.1101/2020.02.20.20025874v1.full.pdf

BioTechniques 69: 179–185 (September 2020) 10.2144/btn-2020-0078