精华预告：

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CD4+T细胞在细胞免疫治疗中同样重要

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体外CD4+T细胞的定向分化及扩增新策略

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活细胞成像是监测CD4+T细胞激活的重要方法

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利用表型观测、mRNA表达、细胞因子分泌等多重检测对Th17进行功能评价

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Cytation5的成像与光信号检测双平台提供以上实验最优检测平台

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免疫治疗的新利器：Th17细胞

杀手T细胞在过继性免疫治疗中一直是最重要的研究对象，然而细胞毒性T细胞在体外扩增环节中的功能退化仍然是有待攻克的问题。在T细胞家族中另一个非常重要的分支——辅助T细胞，近年诸多研究表明，CD4+ T细胞不仅发挥重要的免疫调节作用直接活化CD8+T细胞，还可以通过释放IFN-γ等直接杀伤肿瘤细胞，因此在肿瘤免疫治疗过程中应强调同时激活CD4+T和CD8+T细胞。

CD4+NaiveT细胞在接受APC细胞的信号激活后，受到环境中不同的细胞因子调节可分化至Th1, Th2, Th17等辅助T细胞和调节T细胞(Treg)。图片来源：DOI: 10.1155/2014/928461

由于Th17细胞具有长期自我更新、持久记忆能力的潜质，它一直是自身免疫疾病研究关注的重点之一。但是，Th17之所以能成为我们今天故事的主角，还由于它在如今的肿瘤免疫治疗领域也是风生水起。这是因为Th17有着令科学家非常着迷的特点：亦正亦邪的可塑性。它既可以在特定的环境中发挥优秀的抗肿瘤作用，也有着可怕的促进肿瘤生长的分裂灵魂，近期也有研究发现其特征类似干细胞：永生，不死，多面性。因此，Th17如同体内免疫大战密网中的一个重要节点，如果搞清楚它的调控机制，那么则能够掌握抗肿瘤战争的主动权。

上图展示了Th17细胞的可塑性。不同的细胞因子及信号调节作用下，其可通过多种途径发挥促进/抑制肿瘤生长的能力。图片来源：DOI: 10.1155/2015/314620

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体外Th17诱导分化

想好好的研究Th17细胞在免疫微环境中是怎么实现精分的，当然要先学会体外Th17的召唤术。传统的体外T细胞激活和分化流程耗时耗力，今天介绍的方案是Lonza公司联合BioTek公司推出的一套Th17定向分化及评价的解决方案。我们从Naive的T细胞入手，激活它，改造它。首先，外周血CD4+T细胞由Lonza公司倾情奉献，而激活改造的方法是商品化的试剂盒：Miltenyi 的T Cell Activation/Expansion Kit，没错，只要买买买就可以了。
此前我们提到了T细胞的通用激活方法里包含一种通过特定材料制备的微珠、磁珠等方式，在其表面包被特定的表面抗原的抗体，用于模拟天然的抗原递呈细胞，来激活初始T细胞。本方案里使用的也正是这种方式——MACSiBead™。

Step1:微珠装载

1，将定量的100 μL CD2-Biotin、CD3-Biotin CD28-Biotin抗体 加入至2 mL 管子中并混合。

2，加入500 μL anti-biotin MACSiBead particles  并混合

3，加入200 μL PBS pH 7.2, 缓冲液混合将管子放置在 4℃ 2h并轻轻混合。

Anti-Biotin MACSiBead装载完成可储备使用

Step2:T细胞激活和分化

将装载后的微珠和特定细胞因子诱导剂混合加入到培养CD4+T细胞的24或96孔板内，置于细胞培养箱内7天。

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T细胞激活和分化的多重评估

在这个方案中，我们可以选用三种方式来评价CD4+T细胞的激活和向Th17细胞分化的能力，分别从图像表型分析、细胞内mRNA表达及细胞外因子分泌检测来判断我们的Th17召唤术效果如何。

NO1.活细胞表型分析

同上期方案一样，激活后的CD4T细胞同样会出现明显的成团聚集扩增的现象，利用Cytation5的无标记成像，能够准确清晰的记录CD4+变身的过程。

上图可以看出，右图经过激活后，T细胞抱团扩增。除了直观的观测到T细胞的激活状态，采用活细胞成像监测的最重要的优势在于对细胞本身无标记且无侵入，能够最大程度维持T细胞的活性，为后续的实验流程提供保障。

No2. AlphaLISA检测IL17的分泌

Th17细胞之所以被称作十七哥，正是因为它具有典型的标志性特征：能够大量分泌IL-17细胞因子。所以我们的方案中是否成功诱导出具备功能性的Th17，自然离不开对其分泌IL-17能力进行定量检测。

这种分泌型的小分子，最好的方法就是用均相的高灵敏度微孔板光信号检测记技术了，比如HTRF,FP以及AlphaLISA等。

上图展示了使用AlphaLISA试剂盒定量检测激活分化后的T细胞培养基上清中的IL-17分泌。从标曲中计算可以看出，定向诱导分化组的IL-17的分泌整整提高了100倍。

NO3. 细胞水平mRNA检测

虽然从细胞外分泌的IL-17的定量结果已经基本证实我们定向诱导分化的Th17的功能性，但如果能够得到每个细胞内IL-17合成的情况更好。因此在这里可以应用荧光原位杂交，而Affymetrix的ViewRNA技术通过核酸恒温扩增的方式，极大提高了传统FISH检测的荧光信号，能在较低放大倍数下清晰成像到细胞内的多拷贝甚至单拷贝的mRNA。

上图 在Cytation的20X物镜下，Red: ACTB mRNA；Orange: IL-17FmRNA ；Blue:  DAPI labeled nuclei 。通过Gen5的图像定量分析，可以得到诱导分化组的细胞内IL-17 mRNA表达显著高于未分化组。

经过里里外外的仔细鉴定，通过这个方案，能够有效定向诱导功能性Th17细胞的扩增，当然，得到的这些细胞，就可以继续用于后续的深入研究。

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小结一下

这个故事的主要目的是给大家提供一个体外细胞治疗的研发策略的新的思路和技术路线，在抗肿瘤免疫治疗的战场中，不仅要发动杀手T细胞，辅助T细胞同样不能过，在这里我们通过成像观测、细胞内IL17 mRNA表达、细胞外IL17分泌的多重检测方式，可以全方面对Th17分化效果及功能进行评价。

最后呢，恰好类似我们今天提出的T细胞激活策略，同时拥有CMOS及PMT的Cytation5，不仅仅可以作为活细胞检测系统监测T细胞的激活和分化，她的双平台检测光路发挥的组合优势可实现包括基于成像的mRNA定量，以及基于激光光路的细胞因子Alpha检测等，同时提供信号数据结果和图像定量结果，这样双管齐下，分分钟搞定各种T细胞~~